外泌體分離
2023-04-04 13:48:39
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超速離心方法可以從細(xì)胞培養(yǎng)上清液、血清、血漿、尿液、腦脊液以及其他體液(腹水、羊水、乳液以及唾液等)中的提取外泌體,獲取的高純度外泌體顆粒,可進(jìn)行后續(xù)的NTA、TEM、WB等分析。
樣本準(zhǔn)備
樣本類型 | 樣本要求 | 送樣量 |
血漿樣品 (不能用肝素抗凝) | (1) 用采血針和EDTA抗凝管抽取全血,輕柔上下顛倒混勻后室溫或者4°C保存,并在1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行下一步處理; (2) 4°C條件下,3000× g離心15min,小心吸取上清,注意避免吸入底部和側(cè)面的沉淀物; (3) 將血漿凍存于-80°C; 提示:送樣量最好4 ml以上(分離4 ml血漿約需要8-10 ml全血)。 | >2ml |
血清樣品 (有條件的話盡量采用血漿,避免血小板來源的外泌體影響) | (1) 用采血針和普通采血管(不含抗凝劑,10ml規(guī)格)采血10 ml; (2) 室溫靜置 30 min,然后4°C條件下,靜置3-4小時(shí)(此時(shí)可見血塊析出); (3) 用移液器吸取上面的淡黃色血清(應(yīng)該有4 ml左右)轉(zhuǎn)入15 ml離心管中,4°C條件下 3000g離心15min,小心取上清轉(zhuǎn)入新的離心管中; (4) 將血清樣品置于-80°C保存; 提示:送樣量最好4 ml以上(分離4 ml血清約需要10-15ml全血)。 | >2ml |
細(xì)胞上清 (需采用去除外泌體的培養(yǎng)基) | 細(xì)胞培養(yǎng)基必須使用去除 exosome的血清或者無血清培養(yǎng)基,以降低背景值的干擾(牛血清中含有大量牛源外泌體)。 (1) 細(xì)胞在正常含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間,貼壁細(xì)胞密度在70 %-80 %,懸浮細(xì)胞密度在60 %-70 %; (2) 對于貼壁細(xì)胞,去除原有培養(yǎng)基,換為新的不含外泌體的培養(yǎng)基或者無血清培養(yǎng)基;對于懸浮細(xì)胞,300 g,4°C,10 min收集細(xì)胞; (3) 使用不含外泌體的培養(yǎng)基或者無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24-48 小時(shí),根據(jù)細(xì)胞的生長速度確定收取上清時(shí)間; (4) 收集細(xì)胞上清,300 g,4°C,離心10 min;小心吸取上清,注意避免吸入細(xì)胞或者細(xì)胞碎片; (5) 3000 g,4°C,再次離心15 min,確保將細(xì)胞或者細(xì)胞碎片去除干凈; (6) 上清0.22μm過濾,去除細(xì)胞碎片、凋亡小體和微囊泡; (7) 上清可在4°C短期保存(1-2天),長期保存可凍存于-80°C 。建議細(xì)胞上清分離后盡快進(jìn)行外泌體分離,保存在4°C和-80°C,都會(huì)對產(chǎn)量有一定的影響。 | >20ml |
尿液 | (1) 無菌容器采集前/中后段晨尿100ml,并注意避免細(xì)菌污染,收集前注意對飲食的控制,于4℃臨時(shí)保存(不得超過8 h); 加入蛋白酶抑制劑混合物(1.67 ml of100mM NaN3, 2.5ml PMSF (2 mg/ml in isopropyl alcohol), 50 μl Leupeptin (1 mg/ml in ddH2O)); (2) 并于3000×g離心15min,去除細(xì)胞或細(xì)胞碎片; (3) -80℃冰箱中保存。 | >20ml |
腦脊液 | (1) 收集腦脊液10ml,采集方式為腰椎穿刺,樣本一經(jīng)分離,請務(wù)必立即置于冰上或4℃短暫保存(不得超過4 h),避免受到血液污染,勿使用含肝素抗凝劑的采樣管收集盛放; (2) -80℃冰箱中保存。 | 10ml |
胸水 | (1) 臨床收集胸水后若不能第一時(shí)間處理,請于4℃臨時(shí)保存(不得超過8 h); (2) 將收集到的胸水1000 g離心10 min,收集上清液; (3) 將得到的胸水上清3000 g離心10 min,收集上清; (4) -80℃冰箱中保存。 | 30ml |
腹水 | (1) 臨床收集腹水后若不能第一時(shí)間處理,請于4℃臨時(shí)保存(不得超過8 h); (2) 將采集到的腹水在4℃下(室溫亦可)離心2000 g,20 min,去除腹水中的殘?jiān)?/span> (3) -80℃冰箱中保存。 | 30ml |
膽汁 | (1) 用無菌容器收集膽汁; (2) 將收集到的膽汁在4℃下,3000 g離心10 min去除細(xì)胞沉渣和碎片; (3) 收集膽汁上清液,4℃或者-20℃長期保存。 | 5ml |
檢測周期:
實(shí)驗(yàn)室收到樣本后10-15個(gè)工作日內(nèi)完成檢測,提供外泌體抽提步驟和報(bào)告。